GILSON PIPETMAX 268 실험실용 자동 액체 취급 플랫폼
이익
- PIPETMAX® 268의 자동화는 프로세스를 간소화하여 PCR 정제를 더욱 안정적이고 재현 가능하게 만듭니다.
- 맞춤형 자기 비드 분리기는 최대 96초의 빠른 정제를 가능하게 합니다.amp한 번의 실행으로 효율성을 높입니다.
- 자동화된 프로토콜은 유연하고 사용자 정의가 가능하므로 사용자는 다양한 워크플로 및 애플리케이션에 맞게 변수를 조정할 수 있습니다.
해결된 문제
- PCR 정제는 종종 노동 집약적이고 기술적으로 까다로워서 수동적인 노력과 정밀성이 필요합니다.
- 수동 취급 제한 samp처리량이 너무 많아서 여러 개의 s를 처리하는 데 시간이 많이 걸립니다.amp레.
- 프로토콜은 유연성이 부족하고 용량, 세척 또는 배양 시간과 같은 매개변수를 조정하는 능력이 제한될 수 있습니다.
소개
- PCR 정제 amplicons는 Sanger 및 차세대 시퀀싱(NGS), 유전형 분석, 단일염기다형성(SNP) 검출, 클로닝, 단편 분석, 프라이머 워킹 등 여러 다운스트림 응용 분야에 필요합니다. 이 정제 과정은 DNA 분석에 필수적인 프라이머, 결합되지 않은 뉴클레오타이드, 염, 효소를 제거합니다. amp정화작용은 하지만, 많은 하류 반응에서는 오염물질로 간주됩니다.
- PCR 정제에는 여러 가지 접근 방식이 있습니다. amp아가로스 겔, 스핀 컬럼, 기능성 팁, 효소 분해, 자성 비드 사용을 포함한 다양한 분석 방법이 있습니다. 각 접근 방식은 특정 요구(비용, 속도, 품질)에 부합할 수 있지만, 자동화에 더 적합하고 확장성이 뛰어나기 때문에 자성 비드가 NGS 응용 분야에 일반적으로 사용됩니다²,³. Illumina는 특히 Agencourt® 사용을 권장합니다. AMPNextera® XT DNA 라이브러리 준비 워크플로우(그림 2)의 정제 단계에 ure® XP PCR 정제 시스템을 사용합니다. 많은 NGS 라이브러리 준비 워크플로우에서 AMPIon Torrent를 포함한 ureXP 비드 세척
- Roche, KAPA, New England BioLabs 및 TATAA.
- 그만큼 AMPure XP PCR 정제 시스템은 최적화된 완충액에 고체상 가역 고정화(SPRI) 상자성 비드를 사용하여 100 bp 이상의 단편을 선택적으로 결합합니다. 이후 세척 단계에서는 원치 않는 PCR 성분을 제거하고, 최종 용출 단계를 통해 정제된 PCR을 얻습니다. amp라이콘.
그림 2
Illumina Nextera® XT DNA 라이브러리 준비 워크플로. Samp파일은 표준 경로를 통해 처리되었습니다. tag정신, amplification,를 사용하여 정리 AMP시퀀싱으로 넘어가기 전에 ure® XP 시스템, 정규화 및 풀링을 수행합니다.- 여기에 설명된 자동화된 방법은 전체 유전체 시퀀싱 전에 대장균 gDNA 라이브러리를 정제하는 데 사용되었습니다. PIPETMAX 268 프로토콜은 맞춤형 자기 비드 분리기(부품 번호 SPL-2294)를 사용하여 사용자가 최대 96초까지 처리할 수 있도록 했습니다.amp실행당 횟수(그림 3).
- 맞춤형 자기 비드 분리기(부품 번호 SPL-2294)에는 24개의 자석이 포함되어 있으며, 이 자석은 96웰 플레이트에 밀착되도록 올리거나 내릴 수 있습니다. 각 자석은 4개의 웰 사이에 위치하여 자기 비드를 각 웰의 모서리로 끌어당깁니다.
재료 및 방법
도서관 건설
- NGS 라이브러리는 Nextera® XT DNA 라이브러리 준비를 사용하여 E. coli K12 gDNA에서 생성되었습니다.
- 제조업체 사양에 따라 PIPETMAX 268에서 키트(Illumina 부품 번호 FC-131-1005)를 사용했습니다. 4개의 고유한 프라이머 세트를 사용하여 gDNA를 준비했습니다.amples(0.2ng/uL에서 1ng) 다음 tag멘션.
AMPure XP 자동 프로토콜
처리할 라이브러리 웰을 제외한 모든 프로토콜 변수에는 기본값이 사용되었습니다(그림 4).
- 처리할 라이브러리 웰과 같은 변수를 수정하기 위한 사용자 인터페이스ample Tranfer Volume, AMPure® XP 비즈 전달량, 세척 단계 등
- 모든 실험 기구와 시약은 팁(DSF200ST, 부품 번호 F172513), PCR 플레이트(Eppendorf 부품 번호 0030 128.575)를 포함하여 실행 시작 시 PIPETMAX 268 베드에 놓였으며 각 웰에는 50 µL가 들어 있었습니다. amp지원 기반(Applied Biosystems 부품 번호 N8010531)에 있는 라이브러리, 2mL를 포함하는 액체 저장소(Seahorse 부품 번호 201256-100) AMPure XP 비드(Beckman Coulter 부품 번호 A63881) 및 10mL 80% 에탄올, 0.2mL 마이크로Amp 8개 튜브 스트립(Applied Biosystems 부품 번호 N8010580) 각 튜브에는 95 µL RSB 재부유 완충액이 들어 있고, 베드 위에 빈 MIDI 플레이트(Thermo 부품 번호 AB-0859)가 있고, 자기 비드 분리기 위에 또 다른 플레이트가 있습니다(부품 번호 SPL-2294J 및 SPL-2294E)(그림 5).
- PIPETMAX 268의 베드 레이아웃을 위한 사용자 인터페이스. 왼쪽에서 오른쪽, 뒤에서 앞으로 실험실 도구 및 시약: 팁 폐기물 슈트, DSF200ST 팁 랙, DSF200ST 팁 랙, 0.2mL 8-튜브 스트립의 RSB 재부유 완충액, 최종 용출 라이브러리를 위한 빈 MIDI 플레이트, 액체 저장소 AMPure® XP 비드와 80% 에탄올, 시작 물질(amp정리 절차를 위해 강화된 라이브러리, DSF200ST 팁 랙, 그리고 자석 비드 분리기에 빈 MIDI 플레이트를 하나 더 놓습니다.
- AMPure XP 비드(24 µL)를 미리 혼합하여 자기 비드 분리기 위의 MIDI 플레이트의 12개 웰에 옮겼습니다. 12개 amp40 µL의 라이브러리는 PIPETMAX 268을 통해 MIDI 플레이트로 옮겨졌습니다. AMPXP 비즈를 섞었습니다. 자석 비즈 분리기가 작동하여 자석이 MIDI 플레이트에 닿아 비즈가 아래로 당겨졌습니다. 잠시 기다린 후,
각 웰에서 상층액을 제거하여 버렸습니다. 그런 다음 비드를 두 번 세척하고 세척액(80% 에탄올 200 µL)을 첨가한 후 폐기했습니다. 비드를 15분 동안 자연 건조하여 잔류 에탄올을 제거했습니다. 자기 비드 분리기를 분리하여 MIDI 플레이트의 자기장을 제거한 후, RSB(42 µL)를 각 라이브러리에 첨가하고 혼합했습니다. 마지막으로 자기 비드 분리기를 작동시켜 자석을 MIDI 플레이트에 접촉시키고 비드를 아래로 당긴 후, 세척된 라이브러리를 새 MIDI 플레이트로 옮겼습니다.
조각 크기 분석
PCR 정제 후 DNA 단편 크기가 s에 대해 평가되었습니다.amp품질과 일관성. 각 s의 소량(1 µL)ample는 전기영동 칩에 로드되어 Agilent 2100 Bioanalyzer로 분석되어 각 s에 대한 전기영동도 추적을 생성합니다.amp르.
결과 및 토의
- 아젠쿠르 AMPIllumina Nextera® XT DNA 라이브러리 준비 프로세스의 일부로 전체 게놈 시퀀싱을 위해 E. coli K12 gDNA 라이브러리를 정제하는 데 ure XP PCR 정제 시스템이 사용되었습니다.
- 이 프로토콜은 PIPETMAX 268에서 자기 비드 분리기를 사용하여 수행되었습니다. 전기영동도(electropherogram) 추적은 고품질 s를 보여줍니다.amples가 생성되었습니다. 대부분의 단편은 700~2000개 염기쌍 사이였으며, 관찰 가능한 오염은 없었습니다(그림 6).
- Nextera® XT DNA 라이브러리 준비 키트로 처리하고 정제한 E. coli K12 gDNA 단편의 전기영동도 AMPPIPETMAX 268을 사용한 ure® XP PCR 정제 시스템.
- 자동화된 PIPETMAX 268 스크립트는 런타임 변수(표 1)를 조정하여 다양한 워크플로 및 애플리케이션 요구 사항에 맞게 빠르고 쉽게 수정할 수 있습니다. S용 변수amp처리할 시료, 각 시약의 용량, 세척 횟수, 용출량이 포함되어 매우 유연한 솔루션을 제공합니다.
표 1
Agencourt®용 자동화된 PIPETMAX 268 스크립트에 대해 런타임에 조정할 수 있는 변수 AMPure® XP PCR 정제 시스템
| 변하기 쉬운 | 단위 | 기본 | 정보 |
| 처리할 라이브러리 웰 | 없음 | A1:H12 | PCR 반응을 정리하는 데 사용하는 MIDI 플레이트의 웰입니다. |
| Samp전이 용량(µL). | μL | 40 | 정제 과정을 위해 MIDI 플레이트로 옮기는 데 필요한 PCR 반응의 양입니다. |
| AMPure® XP 비즈 전달 볼륨 | μL | 24 | 정리 절차를 위해 MIDI 플레이트로 옮겨야 하는 비드의 양입니다. |
| 배양 시간 | 최소 | 5 | s를 허용하는 시간의 양amp초기 결합을 위해 les와 beads를 실온에서 배양합니다. |
| 세척 단계 | 없음 | 2 | PCR 반응을 세척하는 횟수. |
| 세척 전송 볼륨 | μL | 200 | 각 세척 단계마다 MIDI 플레이트로 옮겨야 하는 세척 용액의 양입니다. |
| 공기 건조 시간 | 분 | 15 | s를 허용하는 시간의 양amp에탄올이 증발하도록 실온에서 les와 beads를 배양합니다. |
| 사용할 용출 완충액 튜브 | 없음 | 1시 8분 | 용출 완충액을 담고 있는 튜브. |
| 용출 완충액 전이 부피 | μL | 42 | 최종 용출 단계를 위해 MIDI 플레이트로 옮기는 용출 완충액의 양입니다. |
| 새로운 플레이트로 라이브러리 용출 | 없음 | 진실 | 용출 완충액을 첨가한 후, 선택적으로 최종 용출량을 새로운 플레이트로 옮깁니다. |
| 최종 용출 전달량 | μL | 20 | 용출된 s의 부피amp프로토콜이 끝나면 새로운 플레이트로 이동합니다. |
주문 정보
| 부품 번호 | 설명 |
| 32100001 | 커버 컷아웃이 있는 PIPETMAX 268 |
| FC10021 | MAX8x200 피펫 헤드 |
| FC10022 | MAX8x20 피펫 헤드 |
| 32000091 | PIPETMAX 268 트레이 384 웰. |
| 32000175 | PIPETMAX 268 팁 어댑터 블록(x 3) |
| 32000321 | TRILUTION® 마이크로 설치됨 |
| 32000177 | PIPETMAX 268용 팁 보관 라이저 |
| SPL-2294J-HDW | 자석 비드 분리기 랙 |
| SPL-2294E-HDW | 자석 비드 분리기 자석 |
| 40000026 | 엄지 나사(x 6) |
| 32000292 | 리로드 블록 클립(x 4) |
| 4214540393 | 세탁기(x 4) |
| 32000303 | 마이크로amp 짧은 96 PCR 튜브 랙 |
| F172513 | 블리스터 포장 DSF200ST 다이아몬드 팁 |
결론
- E. coli K12 gDNA 라이브러리는 Illumina Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트의 일부로 전체 게놈 시퀀싱을 위해 준비되었습니다.
- 아젠쿠르 AMPure XP PCR 정제 시스템은 일반적으로 차세대 시퀀싱 워크플로의 정리 단계에 사용됩니다.
- 이 애플리케이션 노트에서는 자기 비드 분리기를 사용하는 자동 PIPETMAX 268 프로토콜을 설명합니다.
- 변수를 사용하면 사용자는 런타임에 프로토콜을 수정하여 지루하고 기술적으로 어려운 절차에 대한 동적 솔루션을 만들 수 있습니다.
참고문헌
- 아젠쿠르® AMPure® XP 사용 안내서, PCR 정제. PN B37419AA. 미국: 2013. 인쇄.
- Head, S., Komori, HK, LaMere, SA, Whisenant, T., Van Nieuwerburgh, F., Salomon, DR 및 Ordoukhanian, P. 차세대 시퀀싱을 위한 라이브러리 구축: 이상views 및 과제. BioTechniques., 56: 61-77 (2014).
- Bronner, IF, Quail, MA, Turner, DJ, Swerdlow, H. Illumina 시퀀싱을 위한 개선된 프로토콜. Curr Protoc Hum Genet., 18.2, (2009).
- Nextera® XT DNA 라이브러리 준비 참조 가이드. 15031942 v01. 미국 캘리포니아주 샌디에이고. 2016. 인쇄.
상표
모든 제품 및 회사명은 해당 소유자의 상표™ 또는 등록® 상표입니다. 본 문서에 사용된 상표는 상표 소유자와의 제휴 또는 보증을 의미하지 않습니다.
알아채다
본 애플리케이션 노트는 발행 당시 이용 가능한 정보를 활용하여 제작 및 편집되었습니다. 본 애플리케이션 노트는 사전 예고 없이 수정될 수 있습니다.
감사의 말
이 작업은 미국 WI의 Gilson Applications 팀과 Lucigen의 Branedon Converse가 수행했습니다.
- 미국, 위스콘신주
- www.gilson.com/contactus
자주 묻는 질문
정제된 PCR을 사용하여 수행할 수 있는 다운스트림 애플리케이션은 무엇입니까? amp리콘?
정제된 PCR amp리콘은 샌거 시퀀싱과 차세대 시퀀싱, 유전자형 분석, 클로닝, 단편 분석, 프라이머 워킹에 필수적입니다.
몇 초amp맞춤형 자기 비드 분리기를 사용하면 한 번에 얼마나 많은 파일을 처리할 수 있습니까?
맞춤형 자기 비드 분리기는 최대 96초의 처리를 허용합니다.amp한 번에 실행됩니다.
어떤 기술이 사용되나요? AMPure XP PCR 정제 시스템?
이 시스템은 100bp보다 큰 PCR 조각을 선택적으로 결합하기 위해 고체상 가역 고정화(SPRI) 상자성 비드를 활용합니다.
문서 / 리소스
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